La quimioluminiscencia se define como la emisión de radiación electromagnética (normalmente en la región del visible o del infrarrojo cercano) producida por una reacción química.

Cuando esta emisión proviene de organismos vivos o sistemas derivados de ellos, se denomina bioluminiscencia. Ambos fenómenos son procesos luminiscentes que se han identificado tradicionalmente mediante un prefijo que identifica la fuente de energía responsable del inicio de la emisión de radiación electromagnética.

Como la intensidad de emisión es función de la concentración de las especies químicas implicadas en la reacción quimioluminiscencia, las medidas de la intensidad de emisión pueden emplearse con fines analíticos.

Una ventaja de las técnicas quimioluminiscencia es que permiten emplear una instrumentación básica bastante sencilla, ya que el sistema óptico no requiere fuente externa de excitación.

Algunas limitaciones en el análisis por quimioluminiscencia, como la dependencia de la emisión quimioluminiscente de varios factores ambientales que deben ser controlados, la falta de selectividad, ya que un reactivo quimioluminiscente no se limita a un único analito, y finalmente, como ocurre en otros sistemas de detección en flujo, la emisión quimioluminiscente no es constante sino que varía con el tiempo (el flash de luz está compuesto de una señal que se produce tras la mezcla de los reactivos, alcanza un máximo y después cae hasta la línea de base), y este perfil de emisión frente al tiempo puede variar ampliamente en diferentes sistemas quimioluminiscentes, por lo que hay que extremar el cuidado para detectar la señal en sistemas en flujo, midiendo en periodos de tiempo bien definidos.

Hay diferentes formas de luminiscencia, distinguiéndose por el mecanismo que la genera.

La fotoluminiscencia también conocida como fluorescente la sustancia es estimulada por fotones de luz, la emisión de la luz con un trazador fluorescente es diferente.
En bioluminiscencia, una reacción química medida por enzimas es responsable por la excitación, y esta reacción está siempre emparentada a organismos vivos.

En quimioluminiscencia, la emisión de luz es causada por los productos de una reacción específica química, en la cual se involucran las siguientes sustancias según el sistema automatizado que sea utilizado. Los detectores tienen una alta sensibilidad para la determinación del contenido en azufre y nitrógeno de diversos compuestos.

T5Dc ofrece a fetectores para cromatografía selectiva Sievers 355 SCD (detector de quimioluminiscencia de azufre) y 265 NCD (detector de quimioluminiscencia de nitrógeno).

El analizador de azufre utiliza un quemador dual para lograr la combustión a alta temperatura de los compuestos que contienen azufre para formar monóxido de azufre (SO). Un tubo fotomultiplicador detecta la luz producida por la reacción de quimiluminiscencia del SO con el ozono. Esto resulta en una respuesta lineal y equimolar sin interferencia de las matrices de muestra.  Dado que la medición de niveles de traza de azufre es de suma importancia para muchas industrias, el SCD se ha convertido en una herramienta analítica importante para detectar azufre y monitorear la calidad del producto.

Por su parte el detector de quimioluminiscencia de nitrógeno Sievers® 255 (NCD) NCD es un detector de nitrógeno que produce una respuesta lineal y equimolar a los compuestos de nitrógeno.  Esto se logra por medio de un quemador de acero inoxidable que permite una alta temperaura de combustión para pasar compuestos de contienen nitrógeno a óxido nítrico (NO). Un tubo fotomultiplicador detecta la luz producida por la reacción subsecuente de quimiluminiscencia del NO con el ozono.

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La exactitud y calibración de los instrumentos

Una calibración (estandarización) adecuada de los instrumentos es esencial para obtener análisis exactos. La elección de una técnica de calibración depende del método instrumental, de la respuesta del instrumento, de las interferencias  presentes en la matriz de la muestra y del número de muestras por analizar. Tres de las técnicas de calibración más comúnmente utilizadas son la curva analítica o gráfica de trabajo, el método de adiciones estándares y el método de estándar interno.

Calibración por curva – calibración por gráfica analítica

En la técnica de la curva analítica (o de trabajo), se preparan varias soluciones estándares que contienen concentraciones conocidas del analito. Dichas soluciones deben cubrir el intervalo de concentraciones de interés, así como tener una composición matricial tan parecida como se pueda a la de las soluciones de la muestra. También se analiza, una solución de fondo (blanco de reactivos), que contiene solo la matriz del disolvente y las lecturas netas se graficarán contra las concentraciones de las soluciones estándares, a fin de obtener la gráfica de calibración de trabajo. Si se obtiene una gráfica no lineal, como ocurre con frecuencia, puede usarse equipo electrónico o programas computacionales para compensar la curvatura y producir una salida que sea una función lineal de la concentración. En regiones no lineales, el número de soluciones estándares analizadas debe aumentarse para obtener la exactitud del análisis de las muestras problema.

En algunos análisis también puede alcanzarse la linealidad variando parámetros instrumentales. En el análisis espectrofotométrico, cambiar la longitud de onda utilizada para obtener las lecturas de absorción puede producir una gráfica de trabajo más lineal. Es de mayor importancia registrar todos los parámetros instrumentales empleados para obtener los datos de la curva de calibración, porque incluso pequeñas variaciones en estos parámetros pueden afectar la pendiente de la gráfica. La curva de calibración debe ser revisada periódicamente, haciendo uso de soluciones de concentración conocida, para detectar cualquier cambio en la respuesta instrumental.

Calibración por el método de adiciones estándares

Cuando es imposible suprimir interferencias físicas o químicas en la matriz de la muestra puede usarse el método de adiciones estándares. La respuesta del instrumento debe ser función lineal de la concentración del analito, en el intervalo de concentraciones y también debe tener una ordenada al origen en cero (señal cero para concentración cero). Una pequeña cantidad de solución del analito, de concentración conocida, se añade a una alícuota de una solución de muestra analizada previamente, y el análisis se repite usando reactivos, parámetros del instrumento y procedimientos idénticos.

Las lecturas pueden ser corregidas para cualquier señal de fondo. Siempre es aconsejable revisar el resultado con al menos otra adición estándar. Las adiciones estadísticamente óptimas de analito son iguales al doble o la mitad de la cantidad del analito en la muestra original, todas las soluciones deben ser diluidas al mismo volumen final, para que cualquier interferente en la matriz de la muestra tenga un efecto idéntico en cada solución. Debe dejarse transcurrir suficiente tiempo entre la adición del estándar y el análisis final para que el estándar agregado alcance el equilibrio con los interferentes de la matriz.

El método de adiciones estándares es ampliamente utilizado en la química electroanalítica, para obtener resultados más exactos que los que resultan usando curvas de calibración. Como las soluciones problema y estándar se miden en idénticas condiciones, las técnicas voltamperométricas sensibles a la matriz (como la redisolución anódica) dependen casi exclusivamente de las adiciones estándares para resultados cuantitativos. La absorción atómica y la espectrofotometría de emisión de flama, usan este método con matrices de muestras complejas, en donde la viscosidad, la tensión superficial, los efectos de flama y otras propiedades de la solución muestra no pueden reproducirse con exactitud en las soluciones de calibración. Los resultados de las adiciones estándares también proporcionan un medio sistemático de identificar fuentes de error en los análisis, tales como la depleción o degradación de los reactivos de prueba, un instrumento defectuoso o soluciones estándares inexactas.

Calibración por el método del estándar interno

Se emplea un estándar interno para minimizar las diferencias en las propiedades físicas de un conjunto de soluciones muestra que contiene el mismo analito. En este método, una cantidad fija de una sustancia pura se añade tanto a las soluciones muestra como a las soluciones estándares; se determinan luego las respuestas del analito y del estándar interno, cada una corregida por el fondo, y se calcula el cociente de las dos respuestas. Si se controlan los parámetros que afectan las respuestas medidas, la respuesta de la línea del estándar interno será constante, por supuesto que la concentración del estándar interno no es fija; sin embargo, si varía uno o más de los parámetros que afectan las respuestas medidas, dichas respuestas –del analito y del estándar interno- deben ser afectadas por igual. Por lo tanto, el cociente de respuestas (del analito al estándar interno) depende solamente de la concentración del analito.

Comparación de métodos de calibración

Cada método tiene sus ventajas y limitaciones en el análisis cuantitativo. Si el análisis involucra un gran número de muestras e buba matriz de composición general conocida, entonces el uso de una curva de calibración es favorable. Las adiciones estándares generalmente se aplican cuando solo va a analizarse pocas muestras en una matriz compleja. Si la composición de la matriz de muestra es compleja y el análisis incluye varias muestras, entonces el método de adiciones estándares puede ser el procedimiento a elegir.

Cualquiera que sea el método elegido es necesario que los equipos e instrumentos de medición estén calibrados  para asegurar que los resultados presentados serán significativos y que no habrá variaciones provocadas por el equipo o instrumento que se está utilizando durante el análisis.

Instrumentos Científicos y de Laboratorio (ICLAB) es una empresa dedicada a la calibración de instrumentos de medición tales como: espectrofotómetros, potenciómetros,  viscosímetros, balanzas, básculas, entre otros.

El personal de ICLAB está ampliamente capacitado para dar un servicio y asesoría a la mayoría de los instrumentos existentes en el mercado.

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¿Qué es la Calibración de instrumentos?

Se entiende por calibración al conjunto de operaciones que establece, bajo condiciones específicas, la relación entre las señales producidas por un instrumento analítico y los correspondientes valores de concentración o masa del juego de patrones de calibrado.

Calidad de una Calibración
La calidad de la determinación de una concentración no puede ser mejor que la calidad intrínseca de la calibración. Los factores que determinan la calidad de una calibración son:

La precisión de las medidas: estimada a través de la repetitividad y la reproducibilidad de las medidas. La repetitividad se evalúa a través del cálculo de la desviación estándar relativa (RSD%) de la medida de los patrones de calibrado. En la práctica puede ocurrir que la repetitividad para los patrones sea más pequeña que para las muestras, por lo que será necesario fabricar patrones similares a las muestras o agregar el analito a las mismas.

Exactitud de los patrones. El valor de concentración o masa asignado a cada patrón trae aparejado un error pequeño si es preparado a partir de reactivos puros (grado analítico) con estequiometría bien definida. Este error en general se desprecia, frente al error en las medidas de las señales producidas por el instrumento.

Validez de la calibración. Generalmente es el factor más importante. Cuando se calibra un instrumento se debe tener una razonable certeza de que éste responderá de igual manera a los patrones así como a las muestras, aunque estas tengan una matriz relativamente diferente. Si estas diferencias son muy grandes, pueden llegar a invalidar el proceso de calibración. Es necesario estar completamente seguro de que el calibrado es válido antes de utilizarlo para obtener el valor de concentración de muestras incógnita. En caso contrario, pueden cometerse serios errores en la determinación.

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